Bodies Revealed Immunohistochemia i anatomopatologia

1. Stwierdzono, że dimeryczna β-glukozydaza działa znacznie lepiej niż enzym monomeryczny, niezależnie od warunków kinetycznych stosowanych do oznaczenia aktywności enzymu. Ponadto stwierdzono, że wrażliwość obu izoform na imidazol różni się.
2. Chociaż rzeczywiście stwierdzono, że enzym monomeryczny jest stosunkowo niewrażliwy na imidazol, zaobserwowano, że dimeryczna β-glukozydaza jest znacząco aktywowana przez 0,125-0,250 mM imidazol w warunkach stanu wstępnego.
3. Ponadto testy w stanie stacjonarnym wykazały, że dodanie 0,125 mM imidazolu do mieszanin reakcyjnych zwiększa Km enzymu dimerycznego z 2,3 do 6,7 mM. Proponuje się, że aktywacja dimeru β-glukozydazy przez imidazol odbywa się poprzez przejście konformacyjne pozycjonujące enzym w kierunku sprawnej katalizy.

Synteza arabinoamidyny i jej hamowanie w kierunku  β – glukozydazy  ( słodkie  migdały ) w porównaniu z biblioteką galaktonoamidyn.

Enzymatyczna synteza glikozydów cholekalcyferolu z wykorzystaniem  β – glukozydazy  ze  słodkich  migdałów .

β-Glukozydaza ze słodkich migdałów (Amygdalus communis var. ‘Dulcis’) uwięziona na kulkach alginianu wapnia katalizowała syntezę rozpuszczalnego w wodzie 17-O-(D-glukopiranozylo)cholekalcyferolu. Optymalnymi warunkami reakcji były: 60% (wag./wag. D-glukozy) β-glukozydazy, 0,12 mM bufor fosforanowy o pH 6 i 30-godzinny okres inkubacji. β-Glukozydaza katalizowała również reakcję z D-glukozą 2, D-galaktozą 3, D-mannozą 4 i D-fruktozą 5 z ogólnie niską wydajnością w zakresie 3-14%. Oba anomery α/β D-glukozy 2, D-galaktozy 3 i D-mannozy 4 przereagowały, z których dwa pierwsze utworzyły również pochodne C6-O.

Analiza liazy mandelonitrylowej i  beta – glukozydazy  ze  słodkich  migdałów  kombinowanymi technikami elektroforetycznymi

Migdały są bogatym źródłem liazy migdałowej (oksynitrylazy) i beta-glukozydazy. Izolacja tych dwóch enzymów ze słodkich migdałów wymaga frakcjonowanego wytrącania siarczanem amonu, a następnie chromatografii jonowymiennej na kolumnach dietyloaminoetylo-(DEAE) i karboksymetylocelulozy (CMC). W niniejszym badaniu do scharakteryzowania tych dwóch enzymów zastosowano różne techniki elektroforetyczne, takie jak elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), ogniskowanie izoelektryczne w unieruchomionych gradientach pH (IEF-IPG) i elektroforeza kapilarna.

Po raz pierwszy beta-glukozydaza i oksynitrylaza zostały rozdzielone w unieruchomionym gradiencie pH równym jednej jednostce pH. Elektroforeza strefowa kapilarna (CZE) była doskonałym narzędziem do analizy czystości preparatów enzymatycznych, umożliwiając całkowite oddzielenie różnych składników białkowych w zaledwie 15 minut. CZE wykazał zdolność rozdzielczą do rozdzielania form enzymów porównywalną z ogniskowaniem izoelektrycznym w unieruchomionym gradiencie pH.

Przypisanie  beta – glukozydazy ze słodkich  migdałów   do rodziny 1 glikozydazy i identyfikacja jej nukleofila miejsca aktywnego.

Beta-glukozydaza ze słodkich migdałów jest dobrze zbadaną glikozydazą, która została poddana licznym analizom kinetycznym i badaniom hamowania. Jednak nie wiadomo, do której rodziny glikozydaz należy, ani tożsamość nukleofila miejsca aktywnego nie jest znana z pewnością. Można go inaktywować za pomocą specyficznego, opartego na mechanizmie inaktywatora enzymu, fluorku 2-deoksy-2-fluoro-beta-D-glukopiranozylu, który działa poprzez tworzenie stabilnego produktu pośredniego enzymu 2-deoksy-2-fluoro-alfa-D-glukopiranozylu .

• Glikozylowany peptyd obecny w trawieniu trawiennym tego uwięzionego glikozylowego enzymu pośredniego zidentyfikowano przez zastosowanie skanów strat obojętnych na potrójnym kwadrupolowym spektrometrze mas z jonizacją przez elektrorozpylanie.
• Porównawcza analiza chromatograficzna cieczowa/spektrometria masowa trawienia trawiennego znakowanych i niewyznakowanych próbek enzymu potwierdziła unikalną obecność tego peptydu m/z = 1041 w znakowanej próbce.
• Sekwencja tego peptydu została określona jako Ile-Thr-Glu-Gln-Gly-Val-Asp-Glu przez dalszą tandemową analizę spektrometrii masowej w trybie skanowania jonów potomnych w połączeniu z degradacją Edmana oczyszczonego peptydu.
• Tożsamość znakowanego łańcucha bocznego została określona przez dalszą tandemową analizę spektrometrii masowej w trybie skanowania jonów potomnych częściowo oczyszczonej próbki znakowanego peptydu poddanej estryfikacji metylu, przy czym wzór fragmentacji jest zgodny tylko z pierwszym Glu w znakowanej sekwencji .
• Sekwencja wokół tej reszty jest identyczna z sekwencją otaczającą katalityczny nukleofil u wielu członków rodziny glikozydaz 1, co potwierdza przypisanie tego enzymu do tej rodziny.
• Znakowana reszta jest jednak inna niż ta (Asp) zidentyfikowana wcześniej w enzymie z gorzkich migdałów przy użyciu znaczników powinowactwa epoksydu konduritolu, chociaż najwyraźniej jest blisko w sekwencji pierwszorzędowej.