• June 10, 2022

Wymiana ośrodka akustofluidalnego w celu przygotowania bakterii elektrokompetentnych za pomocą pułapki na ścianie kanału

Kompleksowa integracja etapów procesu w zminiaturyzowanej wersji przepływów pracy biologii syntetycznej pozostaje kluczowym zadaniem w automatyzacji projektowania biosystemów. Jednak każdy z tych etapów procesu ma określone wymagania w odniesieniu do warunków środowiskowych, w tym w szczególności składu otaczającego płynu, co sprawia, że ​​integracja jest uciążliwa. Przykładowo transformacja,  czyli  przeprogramowanie bakterii poprzez dostarczenie egzogennego materiału genetycznego (takiego jak DNA) do cytoplazmy, jest kluczowym procesem w inżynierii molekularnej i ogólnie w nowoczesnej biotechnologii.
  • Transformacja odbywa się często poprzez elektroporację,  czyli  tworzenie porów w membranie za pomocą wstrząsów elektrycznych w środowisku o niskiej przewodności. Jednak przygotowanie komórek do elektroporacji może być kłopotliwe, ponieważ wymaga wymiany pożywki wzrostowej (o wysokiej przewodności) na pożywkę o niskiej przewodności, zazwyczaj przeprowadzanej  poprzez  wiele czasochłonnych etapów wirowania.
  • Aby uprościć i zminiaturyzować ten krok, opracowaliśmy urządzenie akustofluidyczne zdolne do nieinwazyjnego łapania bakterii  Escherichia coli  w celu późniejszej wymiany pożywki, co stanowi wyzwanie w urządzeniach akustofluidycznych ze względu na szkodliwe efekty akustycznego strumieniowania.
  • Dzięki ulepszonemu procesowi wytrawiania byliśmy w stanie wytworzyć cienką ścianę pomiędzy dwoma kanałami mikroprzepływowymi, które po wzbudzeniu mogą generować pola strumieniowe, które uzupełniają siłę promieniowania akustycznego, a zatem mogą być wykorzystywane do wychwytywania bakterii. Nasza nowatorska konstrukcja skutecznie wyłapuje  Escherichia coli  przy szybkości przepływu 10 μL min -1  i ma wydajność odzyskiwania komórek na poziomie 47 ± 3% po przemyciu uwięzionych komórek.
  • Aby zweryfikować, czy wydajność urządzenia do wymiany pożywki jest wystarczająca, przetestowaliśmy elektrokompetencję odzyskanych komórek w standardowej procedurze transformacji i stwierdziliśmy wydajność transformacji 8 × 105 CFU  na μg plazmidowego DNA. Nasze urządzenie jest niskonakładową alternatywą dla metod opartych na wirowaniu i otwiera drzwi do miniaturyzacji wielu protokołów mikrobiologicznych i inżynierii molekularnej.

Transformacja ryzosferycznego szczepu Bacillus cereus sensu lato B25 przy użyciu protokołu przygotowania elektrokompetentnych  komórek w temperaturze pokojowej  .

Transformacja bakteryjna jest kluczowym etapem manipulacji genetycznej bakterii. Jednak bakterie Gram-dodatnie są trudne do transformacji i w związku z tym opracowano wiele różnych metodologii. Tutaj zbadaliśmy wydajność transformacji protokołu elektroporacji, zmieniając trzy główne czynniki: skład buforu do elektroporacji, siłę impulsu elektrycznego i skład ośrodka odzyskiwania. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność transformacji została zwiększona, gdy przygotowaliśmy elektrokompetentne ogniwa w temperaturze pokojowej zamiast w lodowatej temperaturze. Wykazano, że protokół wyszczególniony w tej pracy ma zastosowanie do innego szczepu B. cereus i dwóch innych gatunków Bacillus,

Elektrokompetentne komórki bakteryjne w temperaturze pokojowej   poprawiają wydajność transformacji DNA i rekombinacji.

Bakterie kompetentne komórki są niezbędne do klonowania, budowy bibliotek DNA i mutagenezy w każdym laboratorium biologii molekularnej. Spośród różnych metod transformacji, elektroporacja ma najlepszą wydajność transformacji. Dotychczasowe metody elektroporacji polegały na płukaniu i elektroporacji komórek bakteryjnych w lodowatych warunkach, które czynią je kruche i podatne na śmierć. Tutaj przedstawiamy proste metody oparte na zmianie temperatury, które poprawiają wydajność transformacji DNA i rekombinacji w E. coli i kilku innych bakteriach Gram-ujemnych, dzięki czemu oszczędzają czas i koszty. Zwiększona wydajność transformacji dużych cząsteczek DNA jest istotną zaletą, która może ułatwić klonowanie dużych fragmentów z preparatów genomowego DNA i próbek metagenomicznych.

Leave a Reply

Your email address will not be published.