Wymiana ośrodka akustofluidalnego w celu przygotowania bakterii elektrokompetentnych za pomocą pułapki na ścianie kanału

Kompleksowa integracja etapów procesu w zminiaturyzowanej wersji przepływów pracy biologii syntetycznej pozostaje kluczowym zadaniem w automatyzacji projektowania biosystemów. Jednak każdy z tych etapów procesu ma określone wymagania w odniesieniu do warunków środowiskowych, w tym w szczególności składu otaczającego płynu, co sprawia, że integracja jest uciążliwa. Przykładowo transformacja, czyli przeprogramowanie bakterii poprzez dostarczenie egzogennego materiału genetycznego (takiego jak DNA) do cytoplazmy, jest kluczowym procesem w inżynierii molekularnej i ogólnie w nowoczesnej biotechnologii.

Transformacja odbywa się często poprzez elektroporację, czyli tworzenie porów w membranie za pomocą wstrząsów elektrycznych w środowisku o niskiej przewodności. Jednak przygotowanie komórek do elektroporacji może być kłopotliwe, ponieważ wymaga wymiany pożywki wzrostowej (o wysokiej przewodności) na pożywkę o niskiej przewodności, zazwyczaj przeprowadzanej poprzez wiele czasochłonnych etapów wirowania.
Aby uprościć i zminiaturyzować ten krok, opracowaliśmy urządzenie akustofluidyczne zdolne do nieinwazyjnego łapania bakterii Escherichia coli w celu późniejszej wymiany pożywki, co stanowi wyzwanie w urządzeniach akustofluidycznych ze względu na szkodliwe efekty akustycznego strumieniowania.
Dzięki ulepszonemu procesowi wytrawiania byliśmy w stanie wytworzyć cienką ścianę pomiędzy dwoma kanałami mikroprzepływowymi, które po wzbudzeniu mogą generować pola strumieniowe, które uzupełniają siłę promieniowania akustycznego, a zatem mogą być wykorzystywane do wychwytywania bakterii. Nasza nowatorska konstrukcja skutecznie wyłapuje Escherichia coli przy szybkości przepływu 10 μL min ^-1 i ma wydajność odzyskiwania komórek na poziomie 47 ± 3% po przemyciu uwięzionych komórek.
Aby zweryfikować, czy wydajność urządzenia do wymiany pożywki jest wystarczająca, przetestowaliśmy elektrokompetencję odzyskanych komórek w standardowej procedurze transformacji i stwierdziliśmy wydajność transformacji 8 × 105 ^CFU na μg plazmidowego DNA. Nasze urządzenie jest niskonakładową alternatywą dla metod opartych na wirowaniu i otwiera drzwi do miniaturyzacji wielu protokołów mikrobiologicznych i inżynierii molekularnej.

Transformacja ryzosferycznego szczepu Bacillus cereus sensu lato B25 przy użyciu protokołu przygotowania elektrokompetentnych komórek w temperaturze pokojowej .

Transformacja bakteryjna jest kluczowym etapem manipulacji genetycznej bakterii. Jednak bakterie Gram-dodatnie są trudne do transformacji i w związku z tym opracowano wiele różnych metodologii. Tutaj zbadaliśmy wydajność transformacji protokołu elektroporacji, zmieniając trzy główne czynniki: skład buforu do elektroporacji, siłę impulsu elektrycznego i skład ośrodka odzyskiwania. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność transformacji została zwiększona, gdy przygotowaliśmy elektrokompetentne ogniwa w temperaturze pokojowej zamiast w lodowatej temperaturze. Wykazano, że protokół wyszczególniony w tej pracy ma zastosowanie do innego szczepu B. cereus i dwóch innych gatunków Bacillus,

Elektrokompetentne komórki bakteryjne w temperaturze pokojowej poprawiają wydajność transformacji DNA i rekombinacji.

Bakterie kompetentne komórki są niezbędne do klonowania, budowy bibliotek DNA i mutagenezy w każdym laboratorium biologii molekularnej. Spośród różnych metod transformacji, elektroporacja ma najlepszą wydajność transformacji. Dotychczasowe metody elektroporacji polegały na płukaniu i elektroporacji komórek bakteryjnych w lodowatych warunkach, które czynią je kruche i podatne na śmierć. Tutaj przedstawiamy proste metody oparte na zmianie temperatury, które poprawiają wydajność transformacji DNA i rekombinacji w E. coli i kilku innych bakteriach Gram-ujemnych, dzięki czemu oszczędzają czas i koszty. Zwiększona wydajność transformacji dużych cząsteczek DNA jest istotną zaletą, która może ułatwić klonowanie dużych fragmentów z preparatów genomowego DNA i próbek metagenomicznych.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Elektroporacja stała się szeroko stosowaną metodą szybkiego i wydajnego wprowadzania obcego DNA do szerokiego zakresu komórek. Elektrotransformacja stała się preferowaną metodą wprowadzania DNA do prokariotów, które nie są naturalnie kompetentne. Elektroporacja jest szybką, wydajną i usprawnioną metodą transformacji, która oprócz oczyszczonego DNA i kompetentnych bakterii wymaga dostępnych na rynku kontrolerów pulsu genów i kuwet.

W przeciwieństwie do etapu pulsacyjnego, przygotowanie elektrokompetentnych komórek jest czasochłonne i pracochłonne, polegające na wielokrotnym wirowaniu i płukaniu w malejących objętościach sterylnej, zimnej wody lub niejonowych buforów dużych objętości kultur hodowanych do fazy średniologarytmicznej wzrost . Czas i wysiłek można zaoszczędzić, kupując elektrokompetentne komórki ze źródeł komercyjnych, ale selekcja jest ograniczona do powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych E. coli.

Niniejszym rozpowszechniamy szybką i wydajną metodę przygotowania elektrokompetentnej E. coli, która jest używana od pewnego czasu w laboratoriach bakteriologicznych, i może być przystosowana do V. cholerae i innych prokariotów. Chociaż nie możemy ustalić, komu należy przypisać rozwój oryginalnej techniki, niniejszym udostępniamy ją społeczności naukowej.

Przygotowanie wysoce wydajnej elektrokompetentnej Escherichia coli przy użyciu wirowania stopniowego z gęstością glicerolu/mannitolu

Tradycyjne protokoły przygotowania Escherichia coli do elektroporacji są pracochłonne i często zapewniają bardzo zmienną wydajność transformacji. Wiele laboratoriów ucieka się do zakupu drogich, komercyjnie przygotowanych ogniw. W tym artykule opisano prostą metodę wytwarzania elektrokompetentnych bakterii E. coli przez odwirowanie bakterii przez poduszkę z glicerolem/mannitolem. Metoda jest szybka i zastępuje żmudne wieloetapowe procedury dwoma 15-minutowymi wirowaniami. Standardowe szczepy klonujące konsekwentnie wytwarzają ponad 8×10(9)transformantów/μg pUC18, podczas gdy szczepy TG1 i LE392 wykazują wydajność większą niż 3×10(10)/μg DNA.

10-minutowa metoda przygotowania wysoko elektrokompetentnych komórek Pseudomonas aeruginosa: zastosowanie transferu fragmentów DNA między chromosomami i transformacja plazmidu.

Opisano szybką metodę opartą na mikrowirówce do przygotowania elektrokompetentnych komórek Pseudomonas aeruginosa o wydajności transformacji nawet 10 000 razy większej w porównaniu z istniejącymi procedurami. Ta zwiększona wydajność umożliwia teraz wykorzystanie transformacji do wszystkich zastosowań wymagających transferu DNA. Obejmują one transfer mutacji chromosomalnych oznaczonych genami oporności na antybiotyki między szczepami P. aeruginosa, co rozwiązuje zagadkę braku wydajnej i niezawodnej procedury transdukcji tej bakterii.

Nic dziwnego, że sposób pozwala również na bardzo wydajną transformację plazmidami replikacyjnymi, z wydajnościami transformacji w zakresie od 10(7) do >10(11) transformantów na mikrogram DNA. Wreszcie, z wydajnością do >10(3) transformantów na mikrogram DNA, metoda ta w większości przypadków zastępuje koniugację w przenoszeniu niereplikatywnych plazmidów stosowanych w doświadczeniach z zastępowaniem genów, specyficzną integracją genów i mutagenezą transpozonów.

Uproszczona i wydajna metoda elektroporacji Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens jest szeroko stosowanym narzędziem drobnoustrojów w biologii molekularnej roślin do przenoszenia DNA do komórek roślinnych i wytwarzania np. stabilnych lub przejściowych transformantów lub indukowania wyciszania genów. W naszym badaniu przedstawiamy uproszczoną wersję elektrokompetentnego przygotowania komórek, która jest nie tylko efektywna czasowo i kosztowo, ale wymaga minimalnej manipulacji komórkami bakteryjnymi. Do przygotowania kompetentnych komórek Agrobacterium zwykle stosuje się kultury płynne. Aby przezwyciężyć trudności związane z pracą z kulturami płynnymi, proponujemy zawieszenie komórek bakteryjnych bezpośrednio z hodowli na płytkach agarowych na noc.

AGL1 Electrocompetent Agrobacterium - 6x50µl
1283-12	Intact Genomics	6/PK	336 EUR
AGL1 Electrocompetent Agrobacterium - 18x50µl
1283-36	Intact Genomics	18/PK	669 EUR
AGL1 Agrobacterium Strain
STR3006	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
AGL1 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0073	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
GV3101 Electrocompetent Agrobacterium - 6x50µl
1282-12	Intact Genomics	6/PK	336 EUR
GV3101 Electrocompetent Agrobacterium - 18x50µl
1282-36	Intact Genomics	18/PK	669 EUR
EHA105 ElectroCompetent Agrobacterium- 6x50µl
1284-12	Intact Genomics	6/PK	336 EUR
EHA105 ElectroCompetent Agrobacterium- 18x50µl
1284-36	Intact Genomics	18/PK	669 EUR
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium - 6x50µl
1285-12	Intact Genomics	6/PK	318 EUR
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium- 18x50µl
1285-36	Intact Genomics	18/PK	669 EUR
R1000 Agrobacterium Strain
STR0004	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
A4 Agrobacterium Strain
STR3001	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
LBA9402 Agrobacterium Strain
STR3002	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
ATCC15834 Agrobacterium Strain
STR3003	Lifescience Market	100 ul	339 EUR
EHA105 Agrobacterium Strain
STR3004	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
GV3101 Agrobacterium Strain
STR3005	Lifescience Market	100 ul	412 EUR
LBA4404 Agrobacterium Strain
STR3007	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
GV2260 Agrobacterium Strain
STR3008	Lifescience Market	100 ul	339 EUR
EHA101 Agrobacterium Strain
STR3010	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
C58 Agrobacterium Strain
STR3108	Lifescience Market	100 ul	329 EUR
A4 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0068	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
LBA9402 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0069	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
ATCC15834 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0070	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
EHA105 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0071	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
GV3101 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0072	Lifescience Market	100 ul	412 EUR
LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0074	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
GV2260 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0101	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
EHA101 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0104	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
R1000 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0107	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
C58C1 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0108	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
P3301/ LBA4404 Agrobacterium Strain
STR3009	Lifescience Market	100 ul	720 EUR
DH10B Electrocompetent Cells (ig10B) - 6x50µl
1212-12	Intact Genomics	6/PK	175 EUR
DH10B Electrocompetent Cells (ig10B) - 12x50µl
1212-24	Intact Genomics	12/PK	289 EUR
DH10B Electrocompetent Cells (ig10B) - 6x100µl
1214-24	Intact Genomics	6/PK	248 EUR
DH10B Electrocompetent Cells (ig10B) - 12x100µl
1214-48	Intact Genomics	12/PK	404 EUR
BL21(DE3) Electrocompetent Cells - 12x50µl
1252-24	Intact Genomics	12/PK	300 EUR
BL21(DE3) Electrocompetent Cells - 12x100µl
1254-48	Intact Genomics	12/PK	466 EUR
igMax DH10B ElectroCompetent Cells - 6x100µl
1284-24	Intact Genomics	6/PK	357 EUR
p3301/ LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0102	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
pSoup/ GV3101 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0121	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
pSoup/ EHA105 Agrobacterium tumefaciens Strains
S0126	Lifescience Market	100 ul	365 EUR
ig 5-alpha Electrocompetent Cells - 6x50µl
1232-12	Intact Genomics	6/PK	164 EUR
ig 5-alpha Electrocompetent Cells - 12x50µl
1232-24	Intact Genomics	12/PK	258 EUR
ig 5-alpha Electrocompetent Cells - 6x100µl
1234-24	Intact Genomics	6/PK	227 EUR
ig 5-alpha Electrocompetent Cells - 12x100µl
1234-48	Intact Genomics	12/PK	383 EUR
TG1 Phage Display Electrocompetent Cells - 6x100µl
1264-24	Intact Genomics	6/PK	300 EUR
TG1 Phage Display Electrocompetent Cells - 6x50µl
1264-48	Intact Genomics	6/PK	497 EUR
SS320 Phage Display Electrocompetent Cells - 12x50µl
1272-24	Intact Genomics	12/PK	331 EUR
SS320 Phage Display Electrocompetent Cells - 12x100µl
1274-48	Intact Genomics	12/PK	497 EUR
Recombinant Schizosaccharomyces Pombe agl1 Protein (aa 25-969)
VAng-Yyj6277-inquire	Creative Biolabs	inquire	Ask for price
virD2 protein (Agrobacterium tumefaciens) (His tag)
80R-3437	Fitzgerald	50 ug	257 EUR
Agrobacterium sp. 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (aroA)
1-CSB-EP870830ALAE	Cusabio	611.00 EUR 309.00 EUR 1827.00 EUR 939.00 EUR 1218.00 EUR 397.00 EUR	100ug 10ug 1MG 200ug 500ug 50ug
Agrobacterium sp. 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (aroA)
1-CSB-MP870830ALAE	Cusabio	293.00 EUR 963.00 EUR 409.00 EUR 717.00 EUR	100ug 1MG 200ug 500ug
Agrobacterium sp.3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (aroA)
1-CSB-YP870830ALAE	Cusabio	679.00 EUR 335.00 EUR 2172.00 EUR 1051.00 EUR 1442.00 EUR 435.00 EUR	100ug 10ug 1MG 200ug 500ug 50ug
Agrobacterium tumefaciens Single-strand DNA-binding protein (virE2)
1-CSB-YP357288AYS	Cusabio	679.00 EUR 335.00 EUR 2172.00 EUR 1051.00 EUR 1442.00 EUR 435.00 EUR	100ug 10ug 1MG 200ug 500ug 50ug
Agrobacterium tumefaciens Single-strand DNA-binding protein (virE2)
1-CSB-EP357288AYS	Cusabio	611.00 EUR 309.00 EUR 1827.00 EUR 939.00 EUR 1218.00 EUR 397.00 EUR	100ug 10ug 1MG 200ug 500ug 50ug

Ponadto zoptymalizowaliśmy kilka parametrów, aby uprościć procedurę i zmaksymalizować liczbę transformantów (np. szczepy Agrobacterium, liczbę etapów płukania, ilość wymaganego plazmidowego DNA, parametry elektroporacji, rodzaj podłoża do inkubacji lub czas inkubacji). Ten zoptymalizowany, prosty i szybki protokół okazał się wystarczająco wydajny, aby uzyskać transformowane kolonie z małymi ilościami (zaledwie 1 ng) plazmidowego DNA. Ponadto umożliwiło nam to również wprowadzenie zligowanych plazmidów bezpośrednio do Agrobacterium z pominięciem etapu transformacji E. coli i dalsze przyspieszenie procedury klonowania.